实验分享 | 竞争法ELISA实验操作指南

　　一、标准品稀释及样品准备

　　样本4℃，1000Xg 5min

　　标准品4℃，10000Xg 1min

　　1mL稀释液溶解标准品，静置1-2min，每管加入500μL标准品&样品稀释液，静置后标准品混匀，将液体离心至底部(800Xg 1min)

　　取同体积标准品原液稀释，涡旋混匀，依次倍比稀释标准品，最后一管为空白

　　二、生物素化抗体工作液制备

　　取5940μL生物素化抗体稀释液，加入60μL浓缩液，稀释100倍后，备用

　　颠倒混匀20次，备用

　　三、标准品及样本、检测抗体点样

　　由低到高浓度，悬空加入，每孔加入50μL，处理后的样品上清溶液，悬空，每孔50μL，生物素化抗体工作液，悬空加入，每孔50μL，腹膜后，标记简称。

　　提前预热，注意温度：37℃孵育45min，1*洗液配制，取288mL双蒸水，取25*浓缩洗涤液12mL，加入烧杯，磁力搅拌器混匀5-10min。

　　四、HRP酶结合物工作液制备

　　取11880μLHRP酶结合物稀释液，加入120μL浓缩液，稀释100倍后，备用。

　　颠倒混匀20次，备用。

　　平衡取出酶标板，勿触摸板条底部。轻撕覆膜，避免液体溅出。参数设定(洗涤次数3次、洗板条数12条、洗涤液量350μL/孔、震板5s)

　　拍干液体，更换吸水纸

　　悬空垂直加入HRP酶结合物工作液，每孔100μL，腹膜后，标记。37℃孵育30min，平衡取出酶标板，勿触摸板条底部，洗涤(参数设定：洗涤次数5次、洗板条数12条、洗涤液量350μL/孔、震板5s)

　　拍干液体，更换吸水纸

　　五、显色

　　悬空垂直加入底物溶液，每孔90μL，腹膜后，标记，37℃孵育15-30min，平衡取出酶标板，切勿触摸板条底部，显色后四孔出现明显蓝色梯度。

　　六、终止反应

　　悬空垂直加入终止液，每孔50μL，加入终止液时可看到蓝色立转为黄色。

　　七、数据处理

　　轻轻擦拭板底，放入酶标仪中，上机操作。

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