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“elisa试剂盒"常见的问题及解答
问:抗原检测出的分子量比资料上的大,是怎么回事?
答:a)抗原形成了二聚体。增多巯基乙醇量,煮沸变性时间延长,可以打开二聚体。b)蛋白本身的修饰如:糖基化,磷酸化等。
问:蛋白转移不到膜上,但胶上有,同时Marker 转上去了,为什么?
答:可能是:a)样品浓度过低;b)转移时间不够。
问:磷酸化抗体的检测样本制备时是否一定要加NaF等?
答:NaF是一种广谱磷酸化酶的抑制剂,一般加。但是不加也可以,大部分时候是不用加的。
问:要验证某个细胞上有无该蛋白的存在,需要做免疫组化和western blot试验吗?做这两个试验时的一抗和二抗可以共用吗?
答:①免疫组化可以用来进行定位,但是不能定量,而且有时会有假阳性,不易与背景区分;Western blot可以特异性检测某个蛋白质分子,进行定量,但是不能定位。
②两种实验的一抗有时候不能通用,公司的产品说明一般都会说明可以进行什么实验,在免疫组化时,是否适合石蜡切片或者冰冻切片。
问:做Western Blot时,提取蛋白后冻存(未加蛋白酶抑制剂),用的博士德的一抗,开始还有点痕迹,现在越来越差,上样量已加到120μg,换了个santa cloz的一抗仍不行。是什么原因?蛋白酶抑制剂单加PMSF行吗?
答:怀疑是样品问题,可能是:1,样品不能反复冻融;2,样品未加蛋白酶抑制剂。同时,建议检查Western Blot过程,提高一抗浓度。对于加蛋白酶抑制剂来说,一般加PMSF就可以了,能多加几中种蛋白酶抑制剂。
问:细胞水平要做western blot,多少细胞提的蛋白够做western blot?
答:一般5×10^6就足够了
问:同一样品能同时提RNA又提蛋白么?这样对western blot有无影响?
答:能,没有问题。
问:同一蛋白样品能同时进行两种因子的Western Blot检测吗?
答:当然可以,有的甚至可以同时测几十种样品。
问:如果目标蛋白是膜蛋白或是胞浆蛋白,操作需要注意什么?
答:如果是膜蛋白和胞浆蛋白,所用的去垢剂要温和得多,这时加上NaF去抑制磷酸化酶的活性。
问:我的样品的蛋白含量很低,每微升不到1微克,但是在转膜时经常会发现只有一部分蛋白转到了膜上,就是在转膜后染胶发现有的孔所有的蛋白条带都在,只是颜色变淡了,有什么办法可以解决?
答:你可以加大上样量,没有问题,还有转移时你可以用减少电流延长时间,加20%甲醇。
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