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九游服务技术解答| ELISA的五种实验原理及常见问题分析
更新时间:2023-12-13浏览:362次

   ELISA的五种实验原理及常见问题分析

  一,简介

  酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay,简写ELISA)指将可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙x等固相载体上,利用抗原抗体特异性结合进行免疫反应的定性和定量检测方法。

  二,实验原理

  主要有 5 种方法:双抗夹心法、竞争法、直接法、间接法、捕获法

  (1)双抗夹心法:适用于大分子物质的检测。将已知的可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙x等固相载体表面,利用抗原抗体特异性结合进行免疫反应的定性和定量检测方法,具有快速、灵敏、简便等优点。

  (2)竞争法:竞争法适用于较少表位的小分子物质。将抗体包被于微孔板中,加入无关蛋白载体封闭未结合位点,加入标准品和生物素标记的抗原物质进行竞争结合。

  (3)直接法:主要用于抗原的检测,将抗原直接固定在固相载体上,洗涤后加入酶标特异性抗体,洗涤后加入底物显色,该方法对抗体的特异性要求较高。

  (4)间接法:主要用于抗体的检测。将特异性抗原包被在固相载体表面,与标本中相应特异性抗体结合,洗涤后加入酶标的抗体,洗涤后加入底物显色。该方法对抗原的特异性要求较高。

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  (5)捕获法:捕获法主要用于血清中某种抗体亚型的检测。先将针对 IgM的第二抗体连接与固相载体,用以结合样品中的所有 IgM,洗涤除去 IgG等无关的物质,然后加入特异性抗原与待检 IgM结合,再加入抗原特异的酶标抗体,最后形成固相二抗-IgM-抗原-酶标抗体复合物,加酶底物显色即可对样品中待检 IgM是否存在及其含量进行测定。

  三,实验步骤(以双抗夹心法为例)

  (1)准备好需要的标准品和试剂

  (2)向孔中加入100ul标准品或待测样本

  37℃孵育2小时, 然后洗板3次

  (3)每孔加100ul生物素化抗体工作液

  37℃孵育1小时, 然后洗板3次

  (4)每孔加100ul链霉亲和素-HRP工作液

  37℃孵育0.5小时, 然后洗板3次

  (5)加入100ul 底物溶液,37℃避光,孵育15-20分钟

  (6)加入50ul终止液

  (7)5min内检测450nm波长的OD值

  校正波长设置为570nm或630nm

  (8)导出数据并进行分析。

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