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ELISA检测试剂盒如何避免假阳性现象及实验关键点
1、加样
对于间接进口标本一般都要进行稀释,如果加样不准就会造成误差,尤其当稀释倍数大时,很小的绝对误差,会导致较大的相对误差,使阴性(或弱阳性)标本呈阳性(或阴性)。加样时应将所加物加在ELISA板孔的底部,避免加在孔壁上部,并注意不可溅出,不可产生气泡。目前,大部分血站都已使用全自动酶免加样系统处理标本,可较好地避免以上误差。
2、洗涤
在进口ELISA检测试剂盒中正确的洗涤是保证得到可重复结果的关健一步,应引起操作者重视。无论是手工操作还是机器操作,得出不正确的结果常与不正确的洗涤有关,ELISA就是靠洗涤来达到分离游离和结合的酶标记物的目的。通过洗涤以消除残留在板孔中没能与固体抗原或抗体结合的物质,以及在反应过程中非特异性吸附于固相载体的干扰物质。
3、 温育
每种试剂都有其*合适的反应模式,其中温度和温育时间控制是重要因素。因孵育温度高,反应时间长,会造成整板本底高,阳性率高。温育一般用湿盒或水浴,反应板不宜叠放,以保证各板温度都能迅速平衡,为避免蒸发,板上应加盖。
4、酶标仪判读
作为记录测定结果的仪器,酶标仪的性能稳定与否,决定结果的可靠度。首先酶标仪应定期进行保养,对滤光片要定期校正;其次酶标仪波长设置要正确,使用双波长,一个检测波长,一个参比波长,以消除微孔板底部划痕、不平、指印或液面高度差异造成的光干扰。此外,在用酶标仪读数时先擦试微孔板底部并压平板条。由于各种酶标仪性能有所不同,使用中应详细阅读说明书
由于酶联免疫吸附技术目前在技术上缺乏标准化,尽管目前国际上以及我国有了部分标准血清或参比血清(血清盘)。但由于受方法学及技术条件的限制,在酶联吸附测定中有时不可避免的会出现一定的非特异性,但我们可以通过以上措施把非特异性显色降至限底,从而提高检测的特异性,并得到更准确、可靠的实验结果。
ELISA实验的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记,其中,结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性,酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性,又保留酶的活性。进行检测时,样品中的受检物质(抗原或抗体)与固定的抗体或抗原结合。通过洗板除去非结合物,再加入酶标记的抗原或抗体,此时,能固定下来的酶量与样品中被检物质的量相关。通过加入与酶反应的底物后显色,根据颜色的深浅可以判断样品中物质的含量,进行定性或定量的分析。由于酶的催化效率很高,间接地放大了免疫反应的结果,使测定方法达到很高的灵敏度。
那么ELISA试剂盒需把握的关键有哪些?
1.在储存及孵育过程中避免将试剂暴露在强光中。一切试剂瓶盖须盖紧以避免蒸发和污染,试剂避免受到微生物的污染,因为蛋白水解酶的干扰将导致呈现错误的结果。
2.小心汲取试剂并严格遵守给定的孵育时刻和温度。请注意在汲取标本/规范品,酶结合物或底物时,di一个孔与一个孔加样之间的时刻距离假如太大,将会导致不同的 “预孵育"时刻,然后明显地影响到测量值的准确性及重复性。
3.试剂盒保存:部分试剂保存于-20℃,部分试剂保存于2-8℃,具体以标签上的标示为准。
4.浓洗涤液会有盐分出,稀释时可在水浴中加温助溶。
5.刚敞开的酶联板孔中可能会含有少许水样物质,此为正常现象,不会对试验结果造成任何影响。
6.一切的样品都应管理好,依照规则的程序处理样品和检测设备。
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