ELISA实验要点：ELISA加样操作您了解多少?
 

　　那在ELISA实验中，加样 一定是绕不开的一环!ELISA测定操作非常简单，一般涉及到样本的收集保存、试剂准备、加样、温育、洗板、显色、结果判断和结果报告及解释等方面，其中任一步骤的不当都会影响测定结果，且尤以加样、温育和洗板等步骤为甚。

　　ELISA实验中一般需要 4 次加样，即加样本、加检测抗体、加底物和加终止液。

　　● 实验室使用的微量加样器应注意保养并定期校正。ELISA比较敏感，每孔加入液体量误差会导致最后读数差别，因此避免仪器带来误差。

　　● 加样前，溶液充分混匀，加样时不可90度向孔中滴加液体，否则会导致液体残留在吸头上，加样不准确。正确加样方法应为45度，吸头贴着孔壁和液面的交界处加入。

　　● 加样品时，单孔用量要求：≥50ul/指标，如需要做复孔则所需样本量≥100ul/指标。如果样本量不充足，具体用量可咨询您的专属销售。

　　● 加样时速度不可过快，否则无法保证微量加样的准确性和均一性。

　　● 加样时避免液体溅出，如有样本溅出，应用吸水纸轻轻拭干，并做相应记录。

　　● 每次加样顺序一致，尤其底物、终止液顺序一致，保证每个孔显色时间相同。

　　● 加完显色液后，放入一个可推拉的抽屉内，就可以避光振荡了。

　　加样防错小窍门

　　(以下问题可能因多种原因引起，本文仅讨论加样的解决方法)

　　Q： 同一个样本间的各个复孔的读数有显著性差异?

　　A： 加样量多少不一，操作时间长短不一。重复同一样本时，加样量与加样时间理应相同，同时也应注意移液器的校准。加样后可轻微晃动酶标板使反应液充分混合。

　　Q： 阳性对照读数不正常?

　　A： 加样量不正确。应保持每次加样的步骤不要有太大的差异，有条件的应该考虑使用排枪。

　　Q： 血清本底高?

　　A： 加样时使用同一枪头、交叉污染。每次吸样注意更换吸头，做到一样一吸头，避免交叉污染。

　　Q： 实验的标准曲线和测定的重复性差?

　　A： 1. 可能原因：加样本及试剂量不准;孔间不一致;校正移液器，吸嘴要配套，装吸嘴时要紧密;重复某一样品时，加样时间尽可能与第一次接近;重复测定标本，操作条件、人员等应尽可能与上次保持一致，以排除这些因素造成的不一致的可能性;样品稀释前应充分混匀。

　　2. 可能原因：加样过快，孔间发生污染;重复测定标本，操作条件、人员等应尽可能与上次保持一致，以排除这些因素造成的不一致的可能性;加样不要过快。

　　3. 可能原因：加错样本;检查记录和试剂，是否加错样本。

　　4. 可能原因：加样本及试剂时，加在孔壁上部非包被区;加样枪头不要贴壁。

　　● 用一张写满字的纸，字越多越好，比如报纸，垫在下面，这样，加过标本的小孔看过去下面的字会变小，没加的字正常，非常容易区分。

　　● 可以利用液面反光与没有加的孔加以区别。

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