elisa试剂盒操作方法、ELISA测定出现问题及解决

　　双抗体夹心法

　　1.包被：用0.05MPH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg/ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃ 过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。(简称洗涤，下同)。

　　2.　加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃ 孵育1小时。然后洗涤。(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。

　　3.　加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。37℃ 孵育0.5～1小时，洗涤。

　　4.　加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃ 10～30分钟。

　　5.　终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。

　　6.　结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+"、“-"号表示。也可测OD值：在ELISA检测仪上，于450nm(若以ABTS显色，则410nm)处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。

　　间接法

　　1.用包被缓冲液将已知抗原稀释至1～10μg/ml，每孔加0.1ml，4℃过夜;

　　2.次日洗涤3次;

　　3.加一定稀释的待检样品(未知抗体)0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37℃孵育1小时,洗涤;

　　4.(同时做空白、阴性及阳性孔对照)于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体(抗抗体)0.1ml;

　　5.37℃孵育35-60分钟，洗涤;

　　6.’最后一遍用DDW洗涤。

　　其余步骤同“双抗体夹心法"的4、5、6。

　　ELISA测定中可能会出现的问题及可能的原因：

　　可能的原因(非试剂盒本身的原因)

　　1.弱阳性质控样本检测不出 温育的时间或温度不够;显色反应时间太短;所用配制缓冲液的蒸馏水有问题

　　2.测定的重复性差 (相同样本两次测定结果不一致) 这是典型的由测定操作引起的问题，包括

　　(1)加样本及试剂量不准;孔间不一致;

　　(2)加样过快，孔间发生污染;

　　(3)加错样本;

　　(4)加样本及试剂时，加在孔壁上部非包被区;

　　(5)不同批号试剂盒中组分混用;

　　(6)温育时间、洗板、显色时间不一致;

　　(7)孔内污染杂物;

　　(8)酶标仪滤光片不正确;

　　(9)血清标本未凝固即加入，反应孔内出现纤维蛋白凝固或残留血细胞，易出现假阳性反应等。

　　3.白板 (阳性对照不显色)

　　(1)漏加酶结合物;

　　(2)洗板液配制中出现问题，如量筒不干净，含酶抑制物(如叠氮钠)等。

　　(3)漏加显色剂A或B;

　　(4)终止剂当显色剂使用。

　　4.全部板孔均有显色

　　(1)洗板不干净;

　　(2)显色液变质;

　　(3)加底物的吸光受酶污染;

　　(4)洗板液受酶等污染

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