实验方法原理:

　　实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

　　仪器、耗材:

　　离心管

　　离心机

　　风光光度计

　　电泳槽

　　凝胶板

　　Realtime PCR仪

　　实验步骤:

　　一、 样品RNA的抽提

　　1. 取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其*溶解。

　　二、 RNA质量检测

　　1. 紫外吸收法测定

　　先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释(1:100)后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液 浓度和纯度。

　　(1)浓度测定

　　A260下读值为1表示40 ug RNA/ml。样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为：A260 x 稀释倍数 x 40 ug/ml。具体计算如下：

　　RNA溶于40 ul DEPC水中，取5 ul，1:100稀释至495 ul的TE中，测得A260 = 0.21

　　RNA 浓度= 0.21 x 100 x 40 ug/ml = 840 ug/ml 或 0.84 ug/ul

　　取5 ul用来测量以后，剩余样品RNA为35 ul，剩余RNA总量为：

　　35 ul x 0.84 ug/ul = 29.4 ug

　　(2)纯度检测

　　RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。

　　2. 变性琼脂糖凝胶电泳测定

　　(1)制胶

　　三、样品cDNA合成

　　四、 梯度稀释的标准品及待测样品的管家基因(β-actin)实时定量PCR

　　五、 制备用于绘制梯度稀释标准曲线的DNA模板

　　六、 待测样品的待测基因实时定量PCR

　　1. 所有cDNA样品分别配置实时定量 PCR反应体系。

　　2. 体系配置如下：

　　序号 反应物 剂量

　　1 SYBR Green 1 染料 10 ul

　　2 上游引物 1 ul

　　3 下游引物 1 ul

　　4 dNTP 1 ul

　　5 Taq聚合酶 2 ul

　　6 待测样品cDNA 5 ul

　　7 ddH2O 30 ul

　　8 总体积 50 ul

　　轻弹管底将溶液混合，6 000 rpm短暂离心。

　　(3)将配制好的PCR反应溶液置于Realtime PCR仪上进行PCR扩增反应。反应条件为：93℃ 2分钟预变性，然后按93℃ 1分钟，55℃1分钟，72℃1分钟，共40做个循环，后72℃7分钟延伸。

　　七、 实时定量PCR使用引物列表

　　引物设计软件：Primer Premier 5.0，并遵循以下原则：引物与模板的序列紧密互补;引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构;引物不在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。

　　八、电泳

       各样品的目的基因和管家基因分别进行Realtime PCR反应。PCR产物与 DNA Ladder在2％琼脂糖凝胶电泳，GoldView染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。